采用共培养方法在室温下以固体方式培养杜英内生菌,培养40d,以乙酸乙酯萃取3次,其浸提物经过正相硅胶柱层析,Sephadex LH-20,半制备液相等方法纯化获得7个次级代谢产物,其结构运用NMR,MS等光谱学方法鉴定,分别为daldinone A(1),alternariol(2),4-methylalternariol(3),alternuene(4),(E)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione(5),(Z)-3-benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione(6),甘油三醋酸酯(7).化合物1-7是首次从杜英的内生菌中获得,化合物1具有抗菌活性,化合物6首次从自然界中分离得到.
甘油是生物柴油的副产物,因其价格低廉和高还原性,成为生物发酵的重要碳源.为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力,从而提高萜类化合物的合成能力,本研究从β-胡萝卜素高产菌CAR015出发,对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控.首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glpR基因,然后分别用M1-37、M1-46和M1-93三个不同强度的人工调控元件对glpFK,glpD和tpiA三组基因进行单基因调控和多基因组合调控.研究发现用M 1-46调控glpD基因后p-胡萝卜素产量达到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100％;调控tpipA基因后β-胡萝卜素产量略有提高;调控glpFK基因后p-胡萝卜素产量略有降低.说明G1pD是甘油代谢途径中的关键限速步骤.Q-PCR结果表明,降低甘油代谢途径的glpD和glpFK基因转录水平,增加tpiA基因转录水平,可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量,可能是因为减少了丙酮醛毒性所致.组合调控glpD和tpiA基因,获得β-胡萝卜素产量最高菌株Gly003,其p-胡萝卜素产量达72.45 mg/L,产率达18.65 mg/g每克干细胞,分别是出发菌株CAR015的5.23倍和1.99倍.总之,GlpD是甘油代谢途径中的关键限速步骤,适当强度调控glpD,可以有效提高重组大肠杆菌的p-胡萝卜素产量.
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